El Instituto de Investigación Sanitaria Incliva, del Hospital Clínico de Valencia, ha desarrollado, junto con Sequencing Multiplex S.L, la técnica Easy one-step amplification and labeling para la detección de copy number variationso CNVs(EOSAL-CNVs) para la que se ha solicitado la correspondiente patente.
Las CNVs suponen la pérdida o ganancia desde unos cientos de bases hasta cientos de miles o millones de nuestro ADN. También se llaman grandes reordenamientos (grandes inserciones o deleciones) y muchas de ellas son causantes de enfermedades hereditarias y tienen implicaciones en el desarrollo y evolución de tumores.
Los resultados de la investigación, dirigida por el Dr. Felipe Javier Chaves, director de la Unidad de Genómica y Diabetes de Incliva e investigador adscrito a Ciberdem, y Carmen Ivorra, directora científica de Sequencing Multiplex SL, se recogen en el artículo Easy one-step amplification and labeling procedure for copy number variation detection, recientemente publicado en Clinical Chemistry, la principal revista internacional de ciencias de laboratorio clínico.
El principal objetivo era verificar que la técnica se puede utilizar en la detección de CNVs en el diagnóstico genético de diferentes enfermedades
El estudio tenía como principal objetivo verificar que la técnica se puede utilizar en la detección de CNVs en el diagnóstico genético de diferentes enfermedades. Durante su desarrollo, se realizó su validación técnica y se comparó con la técnica Gold Standard existente en la actualidad, que es el MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification, o amplificación múltiple dependiente de la ligación de sondas), un sistema para la detección de CNVs mediante varias reacciones seguidas que suponen hasta dos días de trabajo para obtener un resultado.
La metodología que aporta la investigación supone un importante avance al facilitar los estudios de estas alteraciones genéticas, ya que simplifica enormemente su trabajo y reduce costes en reactivos y en tiempo y totales para obtener los resultados. Además, el trabajo presentado demuestra que es una técnica totalmente fiable.
Se basa en la amplificación proporcional y marcaje de amplicones (cada una de las regiones que se analizan en el kit) en una PCR única, seguida del análisis de fragmentos y su cuantificación mediante electroforesis capilar. La PCR es la amplificación de ADN mediante la reacción en cadena de una DNA polimerasa termoestable; esto supone que de determinadas regiones del ADN podemos obtener millones de copias que nos permiten el análisis concreto de estas regiones.
Esta técnica está permitiendo el desarrollo de protocolos y kits para la preparación de librerías de NGS en un solo paso de PCR
En el trabajo se demuestra que esta técnica es válida para caracterizar CNVs en LDLR (gen causante de hipercolesterolemia familiar), en BRCA1, BRCA2, CHECK2, genes cuyas mutaciones pueden causar cáncer de mama hereditario (hasta el 10% de estas mutaciones son del tipo CNV); en MLH1, MSH2, MSH6, EPCAM, genes cuya alteración causa cáncer de colon hereditario no polipósico o síndrome de Lynch; y análisis del cromosoma 17, en especial del genTP53, uno de los principales genes reguladores del daño en el ADN, que se encuentra mutado en el 50% de los tumores y, como enfermedad hereditaria, causa el síndrome de Li-Fraumeni, una enfermedad rara que se caracteriza por la presencia de diferentes tipos de tumores, proporcionando una alternativa rápida y sencilla frente a los métodos actuales existentes.
La investigación, que ha contado con una financiación de 150.000€, aportada por Sequencing Multiplex SL, tendrá continuidad en futuros estudios de validación y la aplicación de esta técnica al diagnóstico genético en otras enfermedades.
Finalmente, hay que indicar que esta técnica está permitiendo el desarrollo de protocolos y kits para la preparación de librerías de NGS en un solo paso de PCR; mientras que las técnicas actuales suponen varios pasos de PCR, ligación, etc. Estos procedimientos simplificarán en gran medida el trabajo de laboratorio al reducir la complejidad, reducir costes, tiempos de trabajo y evitar contaminaciones y posibles errores de manipulación.